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6.5.5.1侵入试验前样品的无菌检查（每批用20支样品）

1） 胰酪胨大豆肉汤培养基每管装量分别15 mL，400 mL /瓶经121℃、15分钟高压灭菌。用于无菌检查、培养基的灵敏度检查、菌悬液增菌制备。

2） 将20支规格为5g的盐酸利多卡因透明质酸钠凝胶依次编号为1.2.3.4.5………20，同样再将20支装有15 mL的胰酪胨大豆肉汤培养基管依次编号为1.2.3.4.5……….20，在无菌条件下，用推杆缓慢将编号为1.2.3.4.5………20的盐酸利多卡因透明质酸钠凝胶1 g，直接加入编号1.2.3.4.5…….2 0的胰酪胨大豆肉汤培养基管，接种后轻轻摇动，使混匀。取含15 mL已灭菌的胰酪胨大豆肉汤培养基空白管1支为阴性对照管。

3） 所有胰酪胨大豆肉汤培养基管于30～35℃培养14天，观察结果。将无菌检查结果填入无菌检查结果记录在“测试报告7”中，可接受标准为应无菌。

6.5.5.2 侵入试验前样品培养基的灵敏度检查

1） 无菌检查培养14天后，所有培养基管都应无微生物生长，取上述混合后的20支试管，每个试管内接种0.1 mL（0.1 mL含10～ 100cfu）的挑战试验用微生物—铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的菌悬液。在30～35℃下培养7天。如在7天内，所有接种试管内的微生物生长良好，则说明试管内培养基营养符合要求，盐酸利多卡因透明质酸钠凝胶供试品无抑菌作用。

2） 使用革兰染色和紫外灯下肉汤呈蓝绿色荧光的性质，来鉴定并确认试样容器内生长的菌为接入的铜绿假单胞菌。将培养基的灵敏度检查结果填入“测试报告8”，应合格。

6.5.5.3挑战菌悬液的制备

1）从铜绿假单胞菌的新鲜斜面上取一整环培养物，分别接入6个含10 mL胰酪胨大豆肉汤无菌培养基的试管中，在30～35℃下，增菌16～18小时。

2）将6管的培养物分别转入盛有400 mL胰酪胨大豆肉汤培养基的6个锥形瓶中，于30～ 35℃下培养22～24小时。在培养结束时，能明显见容器内培养基混浊。培养结束后的菌悬液用来挑战预灌装注射器密封件的完整性。

3）将新鲜的挑战微生物菌悬液倒入已灭菌的3000 mL 的烧杯容器中，混匀。取1 mL菌悬液用0.9%无菌氯化钠溶液稀释制成小于300 cfu/ mL的菌悬液进行计数，每步稀释10倍，用胰酪大豆胨琼脂培养基计数，培养48小时。测定的菌悬液浓度大于10⁶cfu/ mL，细菌在显微镜下观察细胞处于生长状态，并且运动活跃，活动性细胞应占90%以上，同时确认生长的微生物就是挑战试验用微生物铜绿假单胞菌。

4）在“测试报告9”中记录菌悬液的制备结果。菌悬液的制备结果应大于10⁶ cfu/mL。

6.5.3.4  微生物侵入试验操作步骤

本试验须在生物安全柜内或其他不影响生产环境的地方进行。

1）将新鲜的挑战菌悬浮液分成三份（以下简称菌悬液）倒入合适的容器中。将三批每批各50支试样（用金属丝固定，10个一捆，共5捆）侵入菌悬液中，应充分接触注射器胶塞和护帽表面，整个试样注射器的外表面应完全浸泡在菌悬液中。试验开始时取一份菌悬液，平板计数每毫升所含的活菌数。并要确认试验用微生物是铜绿假单胞菌。

2）将试样至菌悬液中持续浸泡4h。从菌悬液中取出试样，用无菌注射用水冲洗外表面，（淋洗后的水及用具需要进行121℃、30分钟高压灭菌）擦干试样外壁，然后用75%乙醇消毒外表面，做为挑战试验用的试样。侵入试验结束时，再次用平板计数菌悬液的浓度。与试验开始相比，浸泡结束时的活菌数如有减少，浸泡结束菌悬液浓度对数值的降低应小于1。

3) 取每支挑战试验试样各1 mL分别接入15 mL的胰酪胨大豆肉汤培养基中，在30～ 35℃下培养14天进行无菌检查，另取2支没有浸过菌液的试样按照2）淋洗后，取每支试样1 mL分别接入至2支15 mL的胰酪胨大豆肉汤培养基中，每支再接种10～100 cfu铜绿假单胞菌菌悬液0.1 mL，在30～ 35℃下培养7天，作为阳性对照。

4）将挑战试验用的试样及阳性对照试样分别培养14天和7天，观察每一试样内微生物的生长情况。假如试样长菌，应确认生长菌是否是挑战微生物-铜绿假单胞菌。

5）假如挑战试验用的试样都不长菌，则从挑战试验用的试样中，每个批次取10个试样，依照6.4.5.2方法进行侵入试验前样品培养基的灵敏度检查试验。

6）试验结果记录在“测试报告10”微生物侵入测试记录、“测试报告11”侵入试验阳性对照检查、“测试报告12”侵入试验后培养基灵敏度检查、“测试报告13”微生物侵入试验中。

6.5.3.5  可接受标准

挑战试验用的试样应无微生物生长，阳性对照应有微生物生长，挑战试验合格的样品培养基的灵敏度检查应合格，试验结果记录在“测试报告14”中。